PCR武艺原理和步调
实行办法原理：
及时荧光定量PCR武艺，是指在PCR反响体系中到场荧光基团，使用荧光信号积累及时监测整个PCR历程，最初经过标准曲线对未知模板举行定量分析的办法。
实行步调：
一、 样品RNA的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞，室温安排5分钟使其完全溶解。
2. 两相分散 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中到场0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后殽杂液体将分为下属的赤色酚氯仿相，正中层以及无色水相表层。RNA全部被分派于水相中。水相表层的体积约莫是匀浆时到场的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀 将水相表层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇殽杂以沉淀此中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不偏见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上构成胶状沉淀块。
4. RNA洗濯 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中到场最少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），洗濯RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干枯 警惕吸去大局部乙醇溶液，使RNA沉淀在室温氛围中干枯5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先到场无RNA酶的水40μl用枪反复吹打多次，使其完全溶解，取得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测
1. 紫外吸取法测定
先用浓缩用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少数RNA溶液用TE浓缩（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸取值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
（1）浓度测定
A260下读值为1表现40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)盘算公式为：A260 ×浓缩倍数× 40 μg/ml。具体盘算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100浓缩至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5 ul用来丈量今后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
（2）纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 因素
0.4 M MOPS，pH 7.0
0.1 M 乙酸钠
0.01 M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔最少可以到场25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至掩盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品
取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳
上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品到场上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶最少2-3 cm。
（4）紫外透射光下察看并照相
28S和18S核糖体RNA的带十分亮而浓（其轻重决定于用于抽提RNA的物品种型），外表一条带的密度约莫是底下一条带的2倍。另有约莫察看到一个更小略微分散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）构成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，约莫是由mRNA和别的异型RNA构成。RNA制备历程中假如显现DNA沾染，将会在28S核糖体RNA带的外表显现，即更高分子量的弥散迁徙物质大概带，RNA的降剖解现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳后果。
三、样品cDNA构成
1. 反响体系
序号 反响物 剂量
1 逆转录buffer 2 μl
2 高明引物 0.2 μl
3 卑劣引物 0.2 μl
4 dNTP 0.1 μl
5 逆转录酶MMLV 0.5 μl
6 DEPC水 5 μl
7 RNA模版 2 μl
8 总体积 10 μl
轻弹管底将溶液殽杂，6 000 rpm暂时离心。
2. 殽杂液在到场逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立刻冰水浴至管表里温度一律，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。
3. 取出后立刻95℃干浴3分钟，取得逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、 梯度浓缩的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）及时定量PCR
1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反响前取3 μl按10倍浓缩（加水27 μl并富裕混匀）为1010，依次浓缩至109、108、107、106、105、104，以备用。
2. 反响体系如下：
标准品反响体系
序号 反响物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 阳性模板高明引物F 0.5 μl
3 阳性模板卑劣引物R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq酶 1 μl
6 阳性模板DNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 总体积 50 μl
轻弹管底将溶液殽杂，6 000 rpm暂时离心。
3. 管家基因反响体系：
序号 反响物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 内参照高明引物F 0.5 μl
3 内参照卑劣引物R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq酶 1 μl
6 待测样品cDNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 总体积 50 μl
轻弹管底将溶液殽杂， 6000 rpm暂时离心。
3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反响条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
五、 制备用于绘制梯度浓缩标准曲线的DNA模板
1. 针对每一必要丈量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板举行PCR反响。
2. 反响体系
序号 反响物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 高明引物F 0.5 ul
4 卑劣引物R 0.5 ul
5 dNTP殽杂液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25 ul
轻弹管底将溶液殽杂，6000rpm暂时离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。
（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物对否为单一特异性扩增条带。
（4）将PCR产物举行10倍梯度浓缩: 将PCR产物举行10倍梯度浓缩: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次浓缩至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、 待测样品的待测基因及时定量PCR
1. 一切cDNA样品分散设置及时定量 PCR反响体系。
2. 体系设置如下：
序号 反响物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 高明引物 1 ul
3 卑劣引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液殽杂，6 000 rpm暂时离心。
（3）将配制好的PCR反响溶液置于Realtime PCR仪上举行PCR扩增反响。反响条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最初72℃7分钟延伸。
七、 及时定量PCR使用引物列表
引物计划软件：Primer Premier 5.0，并依照以下准则：引物与模板的序列严密互补；引物与引物之间制止构成安定的二聚体或发夹布局；引物不在模板的非目标位点引发DNA 聚合反响(即错配)。
八、电泳
千般品的目标基因和管家基因分散举行Realtime PCR反响。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物对否为单一特异性扩增条带。
注意事项：
1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长时设定一个荧光强度标准（即PCR扩丰收物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段随意地点上，但实践使用要团结扩增听从，线性回归系数等参数来综合思索。
2.Ct值：在PCR扩增历程中，扩丰收物（荧光信号）抵达阈值时所颠末的扩增循环次数。Ct值具有极好的反复性。
其他：
及时荧光定量PCR武艺好效地处理了传统定量只能尽头检测的范围，完成了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并纪录在电脑软件之中，经过对每个样品Ct值的盘算，依据标准曲线取得定量后果。因此，及时荧光定量PCR无需内标是创建在两个基本之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在抵达Ct值地点的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时弱小偏差尚未扩大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，取得的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性干系由于Ct值与起始模板的对数存在线性干系，可使用标准曲线对未知样品举行定量测定，因此，及时荧光定量PCR是一种接纳外标准曲线定量的办法。
外标准曲线的定量办法比拟内标法是一种准确的、值得信任的封建办法。使用外标准曲线的及时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量办法，已取得全天下的公认，广泛用于基因表达研讨、转基因研讨，药物疗效稽核、病原体检测等诸多范畴。
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编纂于 2020-10-26 · 著作权归作者一切
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